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蛋白质制备色谱的研究

点击数:9952016-01-07 16:16:10 来源: 大有色谱

传统的生物化学分离技术,如盐析、萃取、透析、离心等技术,一般效率较低,但处理量大,设备投资小,作为产品初步分离和纯化仍被广泛地使用,但对一些精细生化产品的分离和纯化受到了许多的限制. 毛细管电泳虽具有高的分离能力,但它固有负载小的特性使其只能是一种很好的分离分析手段,很难成为一种高效的分离制备方法. 相比之下,高效液相色谱的分离制备效率之高,应用范围之广,是其它方法无法相比的,特别是在生物工程技术下游产品的最终纯化过程中是必需的步骤. 某些基因工程产品,生产成本的80 %花在难度大、费用高的分离与纯化上,世界上发达国家都十分重视生物技术的研究与开发. 因而对生物技术下游产品的分离和纯化予以高强度的投资. 我国则把生物技术一直列为高新技术,重点支持,特别是改革开放以来,面对21 世纪,生物高新技术的发展和开发更是方兴未艾.蛋白质制备色谱的研究,早就引起国际学术界的极大兴趣,人们寄希望于用高效液相色谱分离、制备、纯化和大规模提取感兴趣的蛋白质,从而使生物工程下游产品的纯化和制备向降低成本、扩大规模及提高效益的方向发展. 因此,蛋白质制备色谱的研究具有很明显的学术意义和实际应用价值.


1  柱超载环境中蛋白质的制备

液相色谱制备蛋白质的理论基础是以吸附—解附为基本着眼点,无论用那种色谱模式纯化制备蛋白质,都可以从流动相的改变来实现,盐溶液对蛋白质离子交换色谱的吸附—解附,甲醇、乙腈含量的变化对蛋白质反相液相色谱的吸附—解附,特异性解附剂对蛋白质的亲合色谱吸附—解附等均与流动相的组成,浓度等诸参数相关柱超载运行一般不能借助于分析范围内的分离度,因为分析操作在线性范围内,而制备过程是在色谱柱饱和条件下进行的. 柱超载一般有二种方法,一种采用体积超载运行,这时吸附等温线仍然起重要的作用,一种采用溶质超载运行,被纯化的蛋白质的量比较大,这时样品的浓度已超出了吸附等温线范围,因此,吸附等温线不起作用.


1. 1  离子交换色谱制备蛋白质

在用离子交换色谱分离和制备蛋白质的过程中,主要利用蛋白质彼此具有不同的电荷而进行选择性的分离和制备,由于选择的条件各异,蛋白质和离交换填料之间的作用是多种多样的. 因此蛋白质的分离纯化在离子交换色谱上主要控制pH 值的变化和离子强度的梯度,以使被纯化和制备的目标蛋白质具有高的柱容量、高的分离度和高的产量.如大豆蛋白中的胰蛋白酶在离子交换色谱柱上分离纯化比较理想


1. 1. 1  大豆混合蛋白质的提取  

取4~5 粒大豆,研磨均匀取研磨后的粉样1. 0 g ,加入到冷冻的50 mol/ L 的磷酸盐溶液中,调整pH 为6. 8 ,不断摇动萃取30 min ,然后将萃取液在10 000r/min 离心机中离心15 min ,过滤,上部澄清液保存在冰箱中,以备用此混合蛋白质来纯和制备胰蛋白酶.1. 1. 2  大豆蛋白中胰蛋白酶的纯化  胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧合酶这二个重要蛋白都存在于大豆中,脂肪氧合酶是以同功酶的形式存在于大豆花中,而胰蛋白酶抑制剂( t rypsin inhibitor) 存在于大豆的提取物中. 将萃取得到的胰蛋白酶粗品和比较纯化的制品,在四氨基━PEI Vydac silica (5. 5μm)的柱上进行色谱操作,选择纯化条件


2  顶替色谱制备蛋白质

色谱柱中被吸附的组份,为另一种组份或某一顶替剂从液相色谱柱顶替出来的这个过程称顶替色谱. 选择用作顶替剂的基本条件是:在色谱柱中它具有比被顶替的样品或组份较强的亲合力. 用于大规模制备,顶替色谱主要的优点是消除了由于凸形等温线引起峰的拖尾;较高的柱容量防止了在分离和制备上谱带的扩张;具有较的峰容量. 因此,对于蛋白质的制备,特别是精细生化产品它具有潜在的能力. 现将顶替反相液相色谱和离子交换色谱制备蛋白质的研究与结果报告如下.


2. 1  溶质2溶质反相顶替色谱制备蛋白质

液相色谱的选择性依靠溶质组份和洗脱剂组份在填料上的吸附能力的差异. 顶替色谱直接反映被分离组份和顶替剂在填料表面吸附的竞争过程,在研究生物大分子的分离和纯化过程中,在柱超载的状态下,除了使用溶剂(顶替剂) ─溶质顶替模型外,还使用溶质—溶质顶替模型,对分离和纯化蛋白质提供了一种灵活、方便的方法,选择的顶替溶质要有比被纯化的溶质对填料更强的吸附力,这一模型,可使柱容量大大提高,参数的选择也比较简便.


2. 1. 1  实验设计顶替制备色谱多在反相色谱条件下进行. 例如在图4 中的结果. 我们选择牛血清蛋白(BSA) 作为顶替剂,被纯化的组份是核糖核酸酶2A Rnase2A) . 首先把被纯化的组份在超载条件下加于柱上,当记录系统出现突破峰时表示柱已在饱和状态,这时把顶替溶质加在柱上,整个运行是在非线性条件下进行,被顶替的组份在柱内移动,在同一流动相和相同流速下顶替分离,手工收集,用分析系统来测定顶替组份的纯度。


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